一文读懂阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是由造血干细胞PIGA基因突变导致的后天获得性克隆性疾病。临床主要表现为血管内溶血、骨髓造血功能受损及血栓形成等¹。

临床表现

PNH起病隐匿，病程进展缓慢，可累及全身多系统，临床表现见下表²。

 

发病机制

•  PNH的发病机制

①PIGA基因突变：造血干细胞中PIGA基因发生体细胞突变，该突变见于几乎所有PNH患者。

②GPI合成障碍：细胞膜表面糖基磷脂酰肌醇（GPI）是一种糖脂类膜锚定分子，用于将蛋白质锚定于细胞膜表面。PIGA突变导致GPI锚合成缺陷。多数患者PNH克隆扩增与GPI缺陷的造血干细胞逃逸T细胞介导的自身免疫攻击、获得选择性生存优势有关。

③锚连蛋白缺失：CD55、CD59等蛋白依赖GPI锚定于细胞膜。GPI缺陷使这些蛋白无法表达于细胞表面。

④补体介导的细胞破坏：CD55、CD59可抑制补体攻击自身细胞。二者缺失使血细胞（尤其红细胞）失去保护，被补体系统攻击并破坏，导致血管内溶血；补体活化亦与血栓形成相关。

•  PIGA基因突变的特异性

人体GPI合成通路涉及25个以上基因，理论上通路中任一基因突变均可导致GPI合成异常，但临床上PNH患者中发现的突变几乎全部位于PIGA基因，其原因与该基因所处染色体位置有关：

•     PIGA基因位于X染色体。X染色体上的基因在细胞内实际表达的等位基因仅一个（女性细胞存在X染色体失活），单次体细胞突变即可导致该基因功能丧失。

•     GPI合成通路中的其他基因均位于常染色体，每个细胞含两个等位基因，通常需两个等位基因同时发生突变才会导致功能丧失，其发生概率显著低于X染色体基因的单次突变。

 

 GPI结构及GPI生物合成过程¹

 

•  PIGA基因突变类型

PIGA基因不存在突变热点，突变位点在基因上分布较为均匀，但突变类型与疾病严重程度存在关联：

•     多数突变为小片段插入或缺失，导致移码突变，产生截短、无功能的蛋白产物，多见于III型红细胞。

•     部分突变为错义突变，导致基因功能减弱，进而造成GPI蛋白部分缺陷，多见于II型红细胞。

 

 PIGA基因突变分布及突变类型与II型和III型红细胞关系³

 

 

诊断

•  PNH诊断标准：

需同时满足以下两项²：

1.   临床表现符合PNH。

2.   实验室检查符合下列①、②中至少一项。

•     ① 四项溶血筛查试验（酸化血清Ham试验、糖水试验、蛇毒因子溶血试验、尿潜血或尿含铁血黄素）中两项及以上阳性；

•     ② 流式细胞学检测：外周血中CD55或CD59阴性中性粒细胞或红细胞比例＞10%（5%～10%为可疑）；或FLAER阴性中性粒细胞和/或单核细胞比例＞10%（5%～10%为可疑）。

流式细胞学在PNH诊断中的作用

流式细胞学（FCM）能够检测不同血细胞群GPI锚及锚连蛋白的缺失情况，精确量化PNH克隆大小，对微小克隆的检出灵敏度较高，是PNH检测的金标准?。

目前临床实验室最常用于检测PNH克隆的试剂是CD59单抗和FLAER；CD55单抗因检测敏感度较低，已经很少使用。

CD59主要用于检测红细胞PNH克隆。因其在成熟红细胞表面表达强度较高，可鉴别正常细胞（I型）、部分缺失（II型）和完全缺失（III型）的PNH细胞。CD59在正常粒细胞和单核细胞上表达偏弱且呈连续分布，故不适用于粒细胞和单核细胞PNH克隆的检测。

FLAER是Alexa-488标记无活性的嗜水气单胞菌溶素前体的变异体。其结合靶点是各类 GPI 锚连蛋白共有的GPI锚多糖骨架，可识别所有携带完整GPI锚的细胞。PNH时，FLAER因不能与细胞膜的GPI锚结合，从而表现为阴性，检测结果不受细胞膜表面GPI锚连蛋白的种类、表达量的干扰，也不受输血或溶血影响，是诊断PNH更敏感、更特异的方法。

由于红细胞表面血型糖蛋白的存在会干扰FLAER与GPI锚的结合，FLAER一般只用于粒细胞和单核细胞的检测。

图4 正常GPI锚连蛋白与GPI锚关系结构示意图?

 

注：GPI锚由磷脂酰肌醇（PI）和一个N-葡萄糖胺分子（GlcNH2）、三个甘露糖（Man）和一个乙醇胺分子（EtN）组成，末端甘露糖上的乙醇胺通过酰胺键共价结合锚连蛋白。FLAER能与GPI锚结构中的多糖骨架结合，不依赖任何锚连蛋白。

 

为确保所检测到的GPI阴性细胞群代表PNH克隆，而非表达异常或存在单一GPI锚连蛋白遗传缺陷的细胞，临床上应至少使用两种GPI锚定标志物检测至少两个细胞谱系来识别PNH细胞。粒细胞检测组合一般选用FLAER和CD24，单核细胞检测组合一般选用FLAER和CD14。CD157同时表达于单核细胞和中性粒细胞，也可用来代替CD14和CD24。

需注意：因在持续溶血或输注红细胞的情况下，对红细胞群体的评估可能低估真实的 PNH 克隆大小，因此，白细胞PNH克隆比例更具参考价值。

 

注：左图，I代表CD59部分缺失的红细胞，K代表CD59完全缺失的红细胞；右图，D表示CD24/FLAER双阴性的粒细胞。

 

治疗

既往PNH治疗以对症支持为主，包括输血、红细胞生成刺激剂、雄激素、铁剂治疗，以及针对血栓形成的抗凝治疗。近二十年，补体抑制剂的应用改变了PNH的自然病程，已成为溶血性PNH的重要治疗手段。

依库珠单抗 (Eculizumab) 是国内首个获批用于PNH治疗的C5补体抑制剂；2024年，第三代C5补体抑制剂可伐利单抗 (Crovalimab)也在我国获批PNH适应症。

这些单克隆抗体可特异性靶向补体级联中的关键组分C5，阻止膜攻击复合物 (MAC) 形成，进而抑制血管内溶血。补体抑制剂不仅能有效缓解患者临床症状，还可大幅降低各类严重并发症发生风险，使PNH患者总体生存率提升至接近普通健康人群的水平^?。但目前，造血干细胞移植仍然是唯一的治愈选择。

见康华美已开展PNH检测项目

项目名称：

PNH克隆检测（流式）

基因突变筛查（二代测序）

 

 

作者：陈斌

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献：

 

 

 

 

1.         Brodsky RA. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2014 Oct 30;124(18):2804-11. doi: 10.1182/blood-2014-02-522128.

 

 

2.         中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断与治疗中国指南（2024年版）. 中华血液学杂志2024年8月第45卷第8期. DOI：10.3760/cma.j.cn121090-20240624-00232.

3.         Gurnari C, Pagliuca S, Patel BJ, et al. Implication of PIGA genotype on erythrocytes phenotype in Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. Leukemia. 2021 Aug;35(8):2431-2434. doi: 10.1038/s41375-020-01113-0.

4.         Cançado RD, Araújo ADS, Sandes AF, Arrais C, Lobo CLC, Figueiredo MS, Gualandro SFM, Saad STO, Costa FF. Consensus statement for diagnosis and treatment of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Hematol Transfus Cell Ther. 2021 Jul-Sep;43(3):341-348. doi: 10.1016/j.htct.2020.06.006.

5.         中国生物工程学会细胞分析专业委员会, 中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组, 中华医学会血液学分会红细胞学组. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症流式细胞术检测中国专家共识（2021年版） [J] . 中华血液学杂志, 2021, 42(4) : 281-287. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2021.04.003.

6.         Richard J, Kelly RJ,et al.Treatment outcomes of complement protein C5 inhibition in 509 UK patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.Blood . 2024 Mar 21;143(12):1157-1166. doi: 10.1182/blood.2023021762