【项目速递】三代测序HLA分型-精准分型的新选择

HLA复合体(Human Leukocyte Antigen),是一种存在于人体细胞表面的蛋白,主要用于细胞间识别、抗原识别和抗原呈递。HLA配型是骨髓移植前最重要的检查之一。HLA配型决定了移植供者与受者的基因相符程度,供者和受者HLA相容性越高,排斥反应发生率越低,移植成功率越高。

 

见康华美三代测序HLA分型项目

 

三代测序HLA分型产品:

HLA 11位点高分辨基因分型

HLA 11位点高分辨基因分型+HPA 35位点基因分型检测

 

送样及运输要求

样本要求:3~5mL外周血;EDTA抗凝 (紫帽) 或橼酸钠抗凝 (蓝帽);

运输条件:4℃冷藏运输;

 

报告周期:7个自然日

 

 

一、HLA基因

HLA通常分为三大类——Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类基因:

(1) HLA-Ⅰ类:几乎表达在所有细胞表面,编码的产物主要负责激活CD8+ T细胞,主要包括HLA-A、HLA-B、HLA-C等经典的抗原基因。

(2) HLA-Ⅱ类:主要表达在抗原提呈细胞表面,主要包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等基因;

(3) HLA-Ⅲ类:主要是抗原的补体。

 

图1 HLA基因

 

 二、HLA分型在异基因造血干细胞移植 (allo-HSCT) 中的推荐意见

《人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识》[1]描述了HLA基因分型在临床应用中的推荐意见,摘取部分意见如下:

推荐意见25:对于拟进行初次、二次allo?HSCT的患者和潜在供者,推荐采用NGS或SBT技术,至少检测HLA?A、B、C、DRB1、DQB1位点;增加DPB1、DPA1、DQA1、DRB3/4/5位点,及非经典HLA位点和MIC基因的等位基因型别,可有助于分析和确定allo?HSCT供受者基因型相合程度及单体型是否相合。

推荐意见26:在潜在供者选择中,首选HLA?A、B、C、DRB1、DQB1、DPB1、DPA1、DQA1、DRB3/4/5及更多HLA位点相合的供者;其次选择HLA?A、B、C、DRB1、DQB1位点相合,其他位点有文献报道为可允许的等位基因错配或抗原错配供者。当存在HLA?A、B、C、DRB1、DQB1位点错配时,需进行供受者HLA可允许或不可允许错配分析,选择等位基因为可允许错配或抗原相合的供者。当有多个潜在供者存在相同HLA等位基因或抗原错配时,可结合年龄、性别、ABO血型、HLA抗体(包括DSA、NDSA)及KIR基因分型等结果综合考虑。

考虑移植治疗时应分析更多的HLA位点,为以后移植时可以选择更合适的供者和更好的提示发生排斥反应的风险。

 

三、HLA分型检测常用方法

HLA分型的方法主要有血清/细胞分型和DNA分型

1. 血清/细胞分型:侧重于分析HLA抗原的特异性,主要通过HLA微量淋巴胞毒实验方法来分析HLA类型。

2. DNA分型:侧重于分析基因本身,基于核酸序列的识别方法主要有:中低分辨率的SSP、SSO方法,以及高分辨率的SBT、NGS方法[2]。

SBT(基于测序的分型,Sequencing-based typing)是用两侧引物对HLA基因多态性的区域进行PCR扩增,然后对扩增产物进行Sanger测序,获得HLA等位基因序列从而进行分型;SBT技术依然是目前HLA基因分型的金标准,具有分辨率高、准确性高及特异性强的特点,但其针对 HLA?Ⅰ类基因座位的第2、3、4外显子以及HLA?Ⅱ类基因座位第2、3 外显子的关键区域进行扩增和测序,存在测序区域覆盖不全、难以判断不能确定等位基因型分型结果等局限性。

NGS(下一代测序,Next Generation Sequencing)技术也已广泛应用于HLA分型,NGS 技术是对HLA基因组全长序列进行测序,其测序的深度和广度都高于SBT法,具有通量大、速度快等优势;但由于其是短片段测序,等位基因序列无法完全拼接因而同样会产生不确定的基因型,且GC异常区域NGS测序质量较差从而会影响分型准确性。

 

四、三代测序及其在HLA分型中的优势

三代测序技术是结合了一代和二代测序技术各自的优势的新一代测序技术。主要优势为:1、测序读长更长,reads长度能够达到20 kb,是二代测序的60倍;2、测序准确性高,目前reads准确性能够达到99.95%[3],再加上Pacbio的滚环测序模式,最终测序数据的准确性还可进一步提高。

 

见康华美实验室已将Pacbio测序技术应用于HLA高分辨率分型,一次检测即可获得HLA 11个基因的全长序列,完整覆盖目标基因所有外显子与内含子区域,从而准确获取高分辨率的HLA基因分型结果[4]。

 

图2 Pacbio平台检测的HLA基因范围

 

三代HLA 高分辨率分型,解决了一、二代测序产品HLA分型结果模棱两可的难题,能够消除HLA分型时的不确定性,能够纠正常规分型的错误和消除模棱两可的结果[4],分型准确性最高;并通过单倍型的检测结果,对于稀有分型,甚至新分型结果可以一网打尽。有潜力成为临床应用新的“金标准”,助推HLA临床研究进入新阶段。

图3 使用三代测序技术进行HLA分型的优势

 

五、见康华美骨髓移植前后检测项目推荐

 

移植前检测项目:

 

移植后检测项目:

 

 

参考文献:

1. 中国输血协会人类组织抗原专业委员会, 中华医学会血液学分会, 国家血液系统疾病临床 医学研究中心 . 人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识[J]. 中华医学杂志, 2023, 103(31): 2389-2411.

2. Madden K, Chabot-Richards D. HLA testing in the molecular diagnostic laboratory[J]. Virchows Arch. 2019;474:139-147.

3. https://www.pacb.com/revio/

Cereb N, Kim HR, Ryu J, Yang SY. Advances in DNA sequencing technologies for high resolution HLA typing. Hum Immunol. 2015 Dec;76(12):923-7.